Методы пункции и биопсии костного мозга у нечеловеческих приматов: фокус на применении иглы для биопсии

Не-приматы (NHP) являются основными экспериментальными животными для доклинических гематологических исследований, разработки лекарств на основе стволовых клеток, изучения иммунных механизмов и исследований трансляционной медицины. Высокое-качество, низкая-контаминация и полные образцы костного мозга являются предпосылкой и основой надежных экспериментальных данных. Пункция костного мозга и кор-биопсия являются наиболее распространенными методами отбора проб костного мозга in vivo у приматов, не являющихся человеком. В отличие от обычного сбора венозной крови, эта технология основана на использовании профессиональных твердых полых игл для биопсии, которые проникают в кортикальный слой длинных костей и плоских костей и позволяют получить качественную костномозговую жидкость и неповрежденные сердцевинные ткани костного мозга из костномозговой полости. Вся операция во многом зависит от технических характеристик, соответствия модели и стандартизированного применения игл для биопсии костного мозга. В сочетании с протоколами экспериментов на зрелых животных и литературным опытом в этой статье систематически разрабатываются полные-технические характеристики процесса пункции и биопсии костного мозга NHP, уделяя особое внимание характеристикам выбора, преимуществам применения и основам стандартизированной работы специальных игл для биопсии, чтобы обеспечить стандартизированное техническое руководство для исследователей-экспериментаторов.

Основной технический принцип пункции и биопсии костного мозга у приматов, не являющихся человеком, соответствует классической системе отбора проб костного мозга собак (Crow et al., 2009). Основная логика заключается в том, чтобы использовать жесткие полые иглы для биопсии, чтобы преодолеть твердый кортикальный костный барьер, точно определить местонахождение костномозговой полости и получить костномозговую жидкость и твердые образцы керна посредством аспирации под отрицательным давлением и ротационной резки. В соответствии с анатомическими особенностями НЧЧ общие места отбора проб подразделяются на области передних и задних конечностей. Приоритетные места отбора проб задних конечностей включают гребень подвздошной кости и вертельную ямку бедра (Wolf & White, 2012), которые подходят для большинства моделей приматов среднего и крупного-размера; альтернативным местом на передней конечности является большой бугорок плечевой кости, имеющий неглубокое анатомическое положение и удобное управление, подходящий для дополнительных и повторных экспериментов по отбору проб. Различные места отбора проб имеют различия в толщине кости, диаметре костномозговой полости и покрытии мягких тканей, которые необходимо сопоставить с соответствующими характеристиками игл для биопсии костного мозга, чтобы обеспечить эффективность отбора проб и качество образцов.

В качестве инвазивной операции на кости пункция и биопсия костного мозга NHP вызывают определенную стимуляцию тканей и болевой ответ. Чтобы обеспечить благополучие животных и стабильную экспериментальную работу, все операции по отбору проб должны выполняться под стандартной анестезией. Исследователи могут выбрать общую анестезию или местную таргетную анестезию в зависимости от экспериментального цикла, частоты отбора проб и индивидуального состояния животного, чтобы добиться достаточной интраоперационной и послеоперационной анальгезии. Кроме того, весь процесс должен строго соответствовать условиям стерильности эксперимента, включая предоперационное бритье и подготовку кожи места отбора проб, мульти-стандартную дезинфекцию повидоном-йодом и спиртом, укладку стерильных полотенец, ношение стерильных перчаток и хирургических инструментов, чтобы эффективно избежать местной инфекции, воспаления раны и других послеоперационных осложнений, которые влияют на последующие повторные эксперименты.

Классификация, выбор и эксплуатационные преимущества специальных игл для биопсии костного мозга

Игла для биопсии костного мозга является основным прецизионным инструментом для отбора проб костного мозга NHP, который определяет вероятность успеха однократной пункции, целостность образца и степень загрязнения периферической крови. В настоящее время существует несколько готовых коммерческих моделей специальных игл для взятия проб костного мозга у экспериментальных животных, в том числе иглы Rosenthal, Klima, стернальная/подвздошная игла Illinois и игла Джамшиди. Каждая модель имеет различную конструкцию по длине иглы, диаметру калибра, структуре внутреннего стержня и ручному захвату, адаптируясь к различным типам телосложения животных, анатомическим характеристикам костей и целям экспериментального отбора проб.

Среди всех типов иглИгла для биопсии костного мозга Джамшиди 14Gявляется золотым стандартом для биопсии костного мозга NHP, которая является наиболее рекомендуемой спецификацией для экспериментальных операций. Этот тип иглы для биопсии имеет оптимизированную жесткую полую конструкцию с соответствующим центральным твердым стилетом. Корпус иглы имеет умеренную твердость и прочность, что позволяет эффективно проникать в кортикальную кость приматов, не сгибаясь и не скользя. Спиральная режущая кромка на кончике иглы может стабильно внедрять и перехватывать целые ткани сердцевины костного мозга, избегая фрагментации образца и повреждения ткани экструзией, вызванного непрофессиональными типами игл. По сравнению с аспирационными иглами -тонкого калибра, игла для биопсии Джамшиди 14G имеет больший диаметр внутренней полости, что позволяет получать керновые образцы достаточного-объема, обеспечивая при этом безопасность, отвечая требованиям морфологического обнаружения, секционирования тканей и экспериментального индексного анализа при толстой биопсии. По сравнению с толстыми иглами увеличенного размера, она может эффективно уменьшить чрезмерную травму костей и интраоперационное кровотечение, обеспечивая баланс между качеством образцов и повторяемостью использования животных.

Все специальные иглы для биопсии костного мозга имеют соответствующий центральный стилет, который является ключевой структурной особенностью, отличающей их от обычных инъекционных игл. Стилет может полностью блокировать полую полость корпуса иглы во время пункции, предотвращать попадание мягких тканей кожи и костных остатков в полость иглы и блокировать трубопровод, а также обеспечивать плавное продвижение последующей аспирации под отрицательным давлением и разрезания центральной ткани. В экспериментах с повторными выборками исследователям необходимо выбирать характеристики игл в соответствии с массой тела животного и размером костей: короткие и тонкие-иглы для биопсии для мелких приматов (масса тела менее 5 кг) и обычные иглы Джамшиди средней-длины 14G для средних и крупных особей, обеспечивающие точное соответствие оборудования и экспериментальных объектов.

Ключевые предоперационные меры предосторожности при взятии биопсии иглой

Чтобы избежать коагуляции, гемолиза и загрязнения образцов, а также повысить качество отбора экспериментальных образцов, перед отбором проб необходимо соблюдать стандартизированные требования к предварительной обработке и эксплуатации биопсийных игл. Первый,гепариновая антикоагулянтная обработка игл и шприцевявляется обязательным. Перед использованием извлеките небольшое количество раствора гепарина, чтобы промыть внутреннюю стенку биопсийной иглы и соответствующего шприца, и полностью слейте оставшуюся жидкость, образуя однородное гепариновое антикоагулянтное покрытие на внутренней стенке полости иглы. Эта операция может эффективно предотвратить быструю коагуляцию костномозговой жидкости после отбора проб, избежать сбоев в подготовке мазка и обнаружения клеток, вызванных коагуляцией образца, и является ключевым этапом предварительной обработки для получения высококачественной костномозговой жидкости.

Во-вторых, для долгосрочных-экспериментов с повторными выборками животныхротационный выбор мест проколовследует принять во избежание повторных проколов в одном месте, что может привести к гиперплазии кортикальной кости, локальной адгезии тканей и повышенному сопротивлению проколу, что приведет к неудачному отбору проб и увеличению травматизма животных. По схеме обезболивания местное введение анальгетика в кожу и глубокие мягкие ткани места прокола превосходит простую общую анестезию, что позволяет эффективно снять болезненность и дискомфорт послеоперационной раны, снизить стрессовую реакцию животных, облегчить послеоперационное восстановление и последующие повторные эксперименты.

С учетом контроля объема пробы, ограниченного емкостью полости биопсийной иглы и физиологическим объемом крови экспериментальных животных, объем пробы из одного места пункции не должен превышать 2 мл. Чрезмерная экстракция приведет к серьезному разжижению периферической крови, уменьшит долю ядросодержащих клеток и активных тканей костного мозга в образце, повлияет на результаты экспериментального обнаружения и повлияет на точность анализа гематологических показателей и морфологического наблюдения за тканями.

Стандартная операционная процедура пункции гребня подвздошной кости (операция с помощью иглы для базовой биопсии)

Гребень подвздошной кости является наиболее традиционным и предпочтительным местом отбора проб для биопсии костного мозга приматов, отличных от человека. Он имеет толстую кортикальную кость, богатую кроветворной тканью медуллярной полости и небольшое количество прилегающих важных органов, что обеспечивает высокую безопасность и высокую вероятность успеха взятия проб. После того, как животное полностью анестезировано, поместите его в положение лежа, сложите обе нижние конечности под живот, чтобы поднять бедренную кость и полностью обнажить область отбора проб гребня подвздошной кости. У большинства приматов, не являющихся-человеком, волосы в области гребня подвздошной кости редкие, поэтому требуется лишь простое бритье и подготовка кожи. Кожу поочередно дезинфицируют повидон-йодом и спиртом и накладывают стерильное луночное полотенце для изоляции операционного поля и обеспечения стерильности операции.

После подтверждения границы гребня подвздошной кости пальпацией сделайте крошечный разрез кожи стерильным хирургическим лезвием на передней стороне гребня подвздошной кости, чтобы уменьшить сопротивление трения иглы для биопсии во время проникновения. Совместите иглу Джамшиди для биопсии 14G с разрезом, медленно продвигайтесь к переднему дорсальному краю гребня подвздошной кости, все время держите корпус иглы перпендикулярно плоскости гребня подвздошной кости и оказывайте непрерывное и стабильное давление вниз, вращая корпус иглы по часовой стрелке. Вертикальное положение введения иглы является ключом к успешной биопсии, которая может гарантировать, что кончик иглы точно войдет в костномозговую полость, избежать косого проникновения, приводящего к расщеплению кортикальной кости и повреждению прилегающих тканей, а также максимизировать производительность резки и отбора проб кончиком биопсийной иглы.

Когда тело иглы проникает в кортикальную кость, оператор, очевидно, почувствует внезапное снижение сопротивления проникновению, а игла для биопсии может надежно фиксироваться в костной ткани без встряхивания, что указывает на то, что кончик иглы успешно вошел в костномозговую полость. В это время полностью вытащите центральный стилет, подсоедините стерильный шприц емкостью 10 мл к концу иглы для биопсии и создайте стабильное отрицательное давление, потянув за поршень. Свежий костный мозг приматов темно-красный, пенистый, имеет более высокую вязкость, чем периферическая кровь, и содержит крошечную светлую-трабекулярную костную ткань, которая является подходящим образцом костного мозга.

Если костномозговая жидкость не извлекается, не вытягивайте корпус иглы вслепую. Поверните иглу для биопсии на 90–180 градусов, чтобы отрегулировать диапазон резки и отбора проб на кончике иглы; если все еще не удалось, повторно вставьте стилет, слегка отрегулируйте глубину корпуса иглы вперед или назад и снова примените отрицательное давление. Для диагностических экспериментальных образцов объем пробы с одного участка контролируется в пределах 1 мл для обеспечения чистоты образца; Если для экспериментов требуется большой объем образцов костного мозга, для отбора проб следует выбрать несколько мест прокола вместо чрезмерного извлечения из одного места. После взятия пробы быстро вытащите иглу для биопсии, примените прямой компрессионный гемостаз на месте прокола на длительное время и зашейте кожу однониточным швом, если происходит стойкое кровотечение.

Операция пункции и биопсии бедренной вертельной ямки и проксимального конца плечевой кости

Вертельная ямка бедренной кости — идеальное место для дополнительного отбора проб для мелких приматов, не-человека (масса тела<5kg). The local bone structure is shallow, and the medullary cavity is concentrated, which is convenient for the positioning and penetration of fine-gauge biopsy needles. However, the proximal thigh muscle layer of large primates is thick, resulting in large puncture resistance and difficult operation. The core operation principle is consistent with iliac crest biopsy: place the animal in lateral position, hold the proximal thigh with the palm, locate the trochanteric fossa at the inner and distal side of the femoral greater trochanter by thumb palpation, insert the biopsy needle toward the femoral shaft to penetrate into the medullary cavity, and complete negative pressure aspiration and specimen collection according to the standard needle operation procedure.

Проксимальный отдел плечевой кости является еще одним эффективным альтернативным местом отбора проб. Диаметр длинной кости плечевой кости больше, а костномозговая полость шире и тоньше, что делает позиционирование иглы для биопсии более точным и операцию проще. Поместите животное в боковое положение, удерживайте проксимальную часть передней конечности, пальпируйте межбугорковую борозду между большим и малым бугорками плечевой кости, введите иглу для биопсии по направлению к диафизу плечевой кости, чтобы войти в костномозговую полость. На этом участке низкие требования к точности корпуса иглы, низкий процент неудачных проколов и подходит для быстрого отбора проб и серийных экспериментов на животных.

Метод перфузии длинных костей и углубленное применение иглы для толстой биопсии-

В отличие от обычной пункции-одной иглой, метод перфузии длинных костей (Kushida et al., 2000) представляет собой технологию отбора проб костного мозга с высокой-чистотой, подходящую для экспериментов с высокой-точностью и требующую совместного использования двух игл для биопсии костного мозга. Во время операции необходимо ввести соответствующие иглы для биопсии в костномозговую полость на обоих концах стержня длинной кости соответственно, медленно ввести стерильный физиологический раствор через одну иглу для биопсии и собрать костный мозг, -содержащий перфузат, в стерильный закрытый контейнер через удлинительную трубку, соединенную с другой иглой. Этот режим совместной пробы с двойной-иглой эффективно позволяет избежать загрязнения периферической крови при обычной пункции, а полученные образцы костного мозга имеют более высокую чистоту, что подходит для разделения стволовых клеток, культивирования in vitro и экспериментов по высокоточному-детектированию омиков.

Дифференцированная операция аспирации костного мозга и толстой биопсии на основе биопсийных игл

Аспирация костного мозга и кор-биопсия имеют одно и то же место отбора проб и оборудование для биопсийной иглы, но логика послеоперационной работы иглы совершенно различна, что определяет два типа экспериментальных образцов: жидкую жидкость костного мозга и твердую ткань ядра костного мозга. Васпирация костного мозга, после того, как игла для биопсии зафиксирована в костномозговой полости, вытащите стилет и подсоедините шприц, чтобы создать отрицательное давление для извлечения жидкой костномозговой жидкости, которая используется для подсчета клеток, морфологии мазков и обнаружения проточной цитометрии.

Вкор-биопсия костного мозгаориентируясь на образцы тканей, после вытаскивания стилета иглу Джамшиди для биопсии продвигают еще на 1–2 см в костномозговую полость посредством стабильного давления и медленного вращения. Спиральная режущая кромка на кончике иглы может полностью обернуть сердцевинную ткань костного мозга. Затем ослабьте корпус иглы, вращая и раскачивая его, слегка втяните и снова вставьте, чтобы отделить нижнюю часть основной ткани от костной трабекулы. Убедившись, что ткань полностью отделена, вытащите иглу для биопсии целиком с помощью вращательной тракции. Наконец, вытолкните неповрежденный твердый образец ядра костного мозга из полости иглы с помощью линейного толкателя и зафиксируйте его 10% формалином для среза ткани и патологического анализа.

Заключение

Стандартизированное применение игл для биопсии костного мозга является основным ключом к успеху экспериментов по пункции и биопсии костного мозга у приматов, отличных от человека. Игла для биопсии Джамшиди 14G с оптимизированной конструкцией и стабильной производительностью отбора проб является предпочтительным оборудованием для толстой биопсии NHP. Исследователям необходимо выбрать характеристики иглы в соответствии с типом тела животного и экспериментальными целями, строго соблюдать протоколы предварительной обработки гепарином, стерильной операции и ротации участков, а также освоить дифференцированные методы работы аспирации и толстой биопсии. Стандартизированный выбор иглы и ее работа могут эффективно улучшить чистоту и целостность образцов, уменьшить травмы животных и экспериментальные ошибки, а также обеспечить надежную техническую поддержку для доклинических исследований в области гематологии и трансляционной медицины, основанных на моделях приматов, не относящихся к человеку.